影響免疫熒光（IF）實驗結果的因素有哪些？

　更新時間：2023-10-08 點擊量：1104

免疫熒光染色技術是一種以免疫學為基礎，結合生物化學技術和顯微技術發展而來的蛋白等分子檢測技術。那么你知道影響免疫熒光（IF）實驗結果的因素有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！

一、免疫熒光染色方法的選擇

免疫熒光染色技術分為直接法和間接法。

直接法：將熒光標記物偶聯在抗原/抗體上，直接與相應的抗體/抗原反應。

間接法：先用未標記的一抗與抗原充分反應后，再利用熒光標記的二抗與已經結合在抗原上的一抗結合，達到檢測抗原的目的。

	優點	缺點
直接法	操作簡單、特異性高，非特異性染色少便于相同宿主來源的不同蛋白的共定位	靈敏性相對比間接法低
間接法	靈敏度高，染色更加靈活，成本低。	相對直接法操作復雜

二、抗體的選擇

與目標蛋白直接結合的一抗，在條件允許的條件下，盡量選擇相同來源的免疫原或者選擇已驗證種屬反應性的抗體。

如果進行不同目標蛋白的雙染或多染時，這些不同蛋白所對應的一抗應該來源于不同宿主。

	優點	缺點
單克隆抗體	特異性高	靈敏度相對較低，制備過程復雜，價格也相對較高
多克隆抗體	制備過程簡單，周期短，價格相對較低，靈敏度更高，對于表達量較低的目標蛋白更容易檢出。	特異性相對較低

單克隆抗體與多克隆抗體、種屬免疫原、反應性和抗體的宿主來源是抗體選擇最主要考慮的因素，其直接決定著免疫熒光染色的背景、特異性和成敗。熒光偶聯的二抗應選擇與一抗相對應的抗體，及抗一抗的二抗。

三、抗體保存

防止熒光抗體失活、污染以及熒光染料的脫落和淬滅。

在抗體保存過程中，適量分裝，避免反復凍融。

蛋白極易被塑料等吸附，如果用塑料管分裝，抗體中應添加BSA等。

為防止污染也可以添加0.01%的硫柳汞或者0.1%的die氮化鈉。

為防止淬滅，保存熒光抗體時應該注意避光，可以利用錫箔紙包好，或者放在避光的容器中。

四、培養載體的選擇

根據貼壁情況，細胞可分為貼壁細胞和懸浮細胞。

貼壁細胞一般常用24孔細胞培養板培養，接種細胞前放置0.17mm玻璃細胞爬片。

懸浮細胞常用6孔板培養，免疫熒光染色處理后，取少量加在0.17mm玻璃細胞爬片上。

最后將細胞爬片倒扣到載玻片上，封片，放4℃保存。

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