質(zhì)粒構(gòu)建的方法有哪些？

    細菌質(zhì)粒是DNA重組技術(shù)中常用的載體。通過基因工程手段將需要的外源基因送進受體細胞中去進行增殖和表達。將某種目標(biāo)基因片段重組到質(zhì)粒中，構(gòu)成重組基因或重組體。然后將這種重組體經(jīng)微生物學(xué)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，轉(zhuǎn)入受體細胞(如大腸桿菌)中，使重組體中的目標(biāo)基因在受體菌中得以繁殖或表達，從而改變寄主細胞原有的性狀或產(chǎn)生新的物質(zhì)。那么你知道質(zhì)粒構(gòu)建的方法有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！

一、酶切連接

傳統(tǒng)意義上，質(zhì)粒重組是基于堿基互補配對的原理，一般做法為：

1）通過引物在目的片段兩端引入酶切位點；

2）用相同的限制性內(nèi)切酶分別對目的片段和載體進行酶切處理；

3）目的片段和載體的酶切產(chǎn)物在體外連接；

4）連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌；

5）篩選重組子。

在實驗中，我們的每一步都需要根據(jù)該目的基因與載體的特性調(diào)整實驗；考慮到后續(xù)實驗，在選擇載體時務(wù)必要滿足與宿主細胞兼容且容易檢出的條件；

二、Gateway技術(shù)

    高通量基因克隆技術(shù)（Gateway Cloning Technology），是由Invitrogen公司在二十世紀(jì)九十年代末發(fā)明并應(yīng)用于分子生物學(xué)基因克隆的一項zhuan利技術(shù)。它利用專有的重組序列使得DNA片段能夠更有效地被轉(zhuǎn)入質(zhì)粒當(dāng)中，可應(yīng)用于大片段的基因克隆，并且在保持正確閱讀框的前提下讓不同表達載體間的DNA轉(zhuǎn)移成為可能。

    這一技術(shù)在插入的目的DNA片段兩端整合att L1和att L2兩個側(cè)端重組序列（Flanking Recombination Sequence），來構(gòu)建一個類似通道的結(jié)構(gòu)并稱之為“入門克隆"（Gateway Entry Clone），可以避免目的片段內(nèi)存在切點的問題而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率，常應(yīng)用于大規(guī)模的DNA片段整合進同一種表達載體，因此稱之為高通量基因克隆技術(shù)。

三、LIC技術(shù)

    Ligation-Independent cloning，簡稱LIC。采用LIC方法的pET載體是線性化的，在末端有12-15個突出的堿基以在退火時和目的片斷互補。在設(shè)計PCR擴增引物時加入與LIC載體互補的序列，PCR產(chǎn)物用3’→5’的內(nèi)切酶消化出單鏈與載體互補的序列。通過這種方式就可以把目的片斷定向、高效地插入LIC載體上。一般的pET載體是先在不含DE3片段的菌株中進行克隆篩選，之后再把陽性克隆轉(zhuǎn)化進入表達菌株，如BL21（DE3）中，通過IPTG誘導(dǎo)進行表達。

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