細胞傳代培養(yǎng)的常見問題有哪些？

細胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細胞在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使其生長繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。那么你知道細胞傳代培養(yǎng)的常見問題有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！

一、細胞何時進行傳代

通常當細胞生長至wan全匯合進行傳代，避免細胞生長過密，對于特殊情況，比如有接觸抑制的細胞，一般在密度70-80%就進行傳代，避免引起細胞分化。

二、貼壁細胞胰酶消化如何控制時間

貼壁細胞培養(yǎng)一個關鍵步驟胰酶消化，消化過度會導致細胞碎片增多，細胞成片脫落，嚴重影響細胞活性，并有部分細胞漂浮，隨棄去的胰酶流失，消化不足則細胞難于從瓶壁上吹下，反復吹打造成細胞損傷，活性下降。

一般濃度在0.25-0.5%。作用時間根據(jù)細胞種類、作用溫度等因素而變化很大，從幾分鐘到幾十分鐘不等。0.25%的胰酶作用于單層貼壁的細胞，在37度條件下，一般消化1-5分鐘就足夠了。終止是用血清。主要對于新購買的細胞，可以先用低濃度的胰酶去摸索一下消化時間，可每隔1分鐘鏡下觀察細胞是否變圓，記錄最佳消化時間，下一次操作參考之前的記錄來控制時間即可。

三、如何看活細胞

可通過顯微鏡觀察：活細胞中間透亮，飽滿，有光澤，死細胞較暗。或通過臺盼藍染色來計算細胞活力，活細胞排斥臺盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞。有細胞計數(shù)儀的，可直接用計數(shù)儀計數(shù)。

四、細胞傳幾代開始死亡或細胞存活率不佳，增值變慢

可能是培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳；或者消化過度，對細胞有嚴重影響；或者是傳代比例不合適；細胞存在污染等。

五、細胞在培養(yǎng)中常出現(xiàn)黑點

首先肉眼觀察培養(yǎng)液是否變渾濁，如果變渾濁，基本可以確定是污染;如果肉眼觀察培養(yǎng)液沒有變渾濁：在顯微鏡下觀察黑點大小和形狀是否規(guī)則，是否運動，是做布朗運動還是呈直線型快速移動。如果黑點大小不規(guī)則，做布朗運動，黑點可能是細胞碎片(可能是細胞狀態(tài)不佳或者消化過度引起的)，也可能是血清反復凍融產(chǎn)生的蛋白沉淀引起的，也可能是細胞的代謝產(chǎn)物。如果黑點大小一致，快速移動，很可能是細菌污染。

六、細胞成團的原因

1. 消化時吹打太用力，消化太久，消化液太強或有毒性等細胞死亡釋放出DNA，纏繞其他細胞，形成黏性的細胞團。

2. 細胞離心速度過大或時間太長。

3. 消化不wan全的時候，細胞和細胞之間的連接沒有分開；消化過度的時候，圓形的細胞容易聚堆，再分開很困難！

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