Wako磷酸化蛋白分析用——Phos-tag™ 系列產(chǎn)品推介

Phos-tag™是一種可特異性捕獲磷酸化Ser、Thr、Tyr等物質(zhì)的功能分子，由日本廣島大學(xué)大學(xué)院醫(yī)齒藥學(xué)綜合研究科醫(yī)學(xué)品分子機(jī)能科學(xué)研究室開發(fā)。以Phos-tag™ 丙烯酰胺（Phos-tag™ Acrylamide）為首開發(fā)的多種Phos-tag™ 產(chǎn)品被應(yīng)用于世界范圍內(nèi)的基礎(chǔ)研究，并且在GPCR通路及Wnt通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分析方面也取得了優(yōu)秀成果。

一、分離磷酸化蛋白

在制備SDS-PAGE預(yù)制膠過程中加入Phos-tag™ Acrylamide，即可根據(jù)磷酸化水平和磷酸化位點(diǎn)分離磷酸化蛋白與非磷酸化蛋白。

原理：

1. 電泳中的磷酸化蛋白捕獲2個二價(jià)金屬離子。

2. 磷酸化水平越高電泳速度越慢。

3. 根據(jù)磷酸化水平進(jìn)行分離。（即使磷酸化位點(diǎn)的數(shù)目相同，但只要位置不同就能分離）

特點(diǎn)：

可檢測市售抗磷酸化抗體無法檢測的磷酸化蛋白。

可檢測磷酸化水平及磷酸化位點(diǎn)。

可同時(shí)檢測磷酸化與非磷酸化

二、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

①α-casein去磷酸化反應(yīng)隨時(shí)間的變化

使用堿性磷酸酶隨時(shí)間（孵育時(shí)間：0-120 min）處理α-casein，并使用Phos-tag™ SDS-PAGE和常規(guī)SDS-PAGE分離去磷酸化處理的樣品。

② 野生型/突變型Noxa表達(dá)的MCL-1磷酸化水平變化

使野生型（wt）及突變型（3E，KR，5A）的Noxa在肺小細(xì)胞癌細(xì)胞株H209細(xì)胞中表達(dá)，并進(jìn)行細(xì)胞溶質(zhì)（Cytosol）組分和HM（Heavy Membrane，含線粒體較多）組分分離。通過Phos-tag™ SDS-PAGE分離出樣品中的MCL-1（40 kDa），使用抗MCL-1抗體進(jìn)行Western blotting檢測。

③二維電泳中的應(yīng)用： hnRNP K異構(gòu)體的磷酸化分析

●檢測磷酸化蛋白

Phos-tag™ Biotin

Phos-tag™ Biotin是Phos-tag™ 分子與生物素結(jié)合的產(chǎn)品，無需使用抗磷酸化抗體即可檢測與PVDF膜上的磷酸化蛋白。本產(chǎn)品進(jìn)需配合“HRP 結(jié)合親和素"進(jìn)行使用。

特點(diǎn)

1. 結(jié)合與磷酸化種類無關(guān)

2. 推薦用于檢測無合適的抗磷酸化抗體的蛋白

●Phos-tag™ 凝膠熒光染料

Phos-tag™ 凝膠熒光染料，是一種可在生理 pH 范圍內(nèi)，對凝膠中的磷酸化蛋白進(jìn)行染色的熒光染料。進(jìn)行SDS-PAGE后，用本產(chǎn)品處理聚丙烯酰胺凝膠，可以對磷酸化蛋白進(jìn)行特異性染色。本系列有波長不同的Yellow（黃）、Magenta（品紅）、Cyan（藍(lán)綠）、Aqua（淺綠）四種顏色。每管規(guī)格為0.2 mg，可對約20個迷你凝膠進(jìn)行染色。

使用Phos-tag™ 熒光凝膠染色，篩選組氨酸激酶抑制劑。結(jié)果表明，激酶抑制劑對磷酸化存在濃度依賴性抑制。

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