怎么提高質(zhì)粒超螺旋比例

一、質(zhì)粒

質(zhì)粒是一種環(huán)狀的小分子 DNA，是進(jìn)行 DNA 重組的常用載體，在分子生物學(xué)研究和基因治療中對于質(zhì)粒的產(chǎn)量和質(zhì)量都有一定的要求，其中超螺旋比例和內(nèi)毒素含量是影響質(zhì)粒質(zhì)量的兩個重要因素。

雖然超螺旋通常是主要形式，但在所有質(zhì)粒制備中，切口和線性DNA形式通常作為次要形式回收。

但是，如果操作不當(dāng)?shù)脑挘菪问降?/span>DNA質(zhì)粒的收獲率可能不高，那么如何提高質(zhì)粒DNA的超螺旋比例呢？

二、提高質(zhì)粒超螺旋比例的方法

（1）在生長平臺期收獲細(xì)菌培養(yǎng)物

在對數(shù)生長過程中過早收獲細(xì)菌時，經(jīng)常會看到帶切口的 DNA。為避免分離出大量帶切口的DNA，建議收獲進(jìn)入生長平臺期（生長12-16小時后）的細(xì)菌。

（2）不要渦旋和輕輕移液

如果在質(zhì)粒分離過程中將制備物渦旋或過度劇烈搖晃，則可能會因DNA的機(jī)械剪切而出現(xiàn)切口或線性DNA。所以建議輕輕混合，不要渦旋，輕輕少量地移液。

（3）切勿過度使用堿性裂解液

堿性裂解是從基因組DNA中分離質(zhì)粒DNA關(guān)鍵步驟，但如果過度使用，則可能通過將質(zhì)粒長久變性為單鏈環(huán)狀形式來長久破壞質(zhì)粒的超螺旋。所以建議將裂解的孵育時間保持在推薦的時間，并在此步驟中非常輕柔地混合。

（4）小心處理質(zhì)粒重懸液

風(fēng)干后質(zhì)粒重懸期間可能會發(fā)生剪切。質(zhì)粒越大，發(fā)生剪切的可能性就越大。沉淀后輕柔處理制備物，讓DNA吸收到水中，而不是劇烈吹打。

（5）避免核酸內(nèi)切酶

某些細(xì)菌菌株含有核酸內(nèi)切酶A（endA+），可以線性化DNA。建議將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到endA–菌株中，則盡可能高效地進(jìn)行質(zhì)粒制備，以快速將DNA從酶中移開。

（6）保持低溫

有研究表明在較低溫度（4-12°C）下執(zhí)行所有步驟會增加回收的超螺旋質(zhì)粒的量

三、舉例

如圖所示，質(zhì)粒提取之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，開環(huán)質(zhì)粒的占比約20%，說明超螺旋比例低，一般超螺旋比例需要＞90%，一般來說超螺旋比例越高，質(zhì)粒的穩(wěn)定性越高，高超螺旋比例的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染效率、基因表達(dá)水平等方面具有更好的表現(xiàn)。

原因：裂解時間不宜過長，加入裂解液后裂解時間不應(yīng)超過5分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞

解決方法：優(yōu)化裂解時間；確保質(zhì)粒的結(jié)合和所有溶液都在室溫下進(jìn)行，減少離心力對質(zhì)粒超螺旋結(jié)構(gòu)的影響，因?yàn)檫^度的離心可能會破壞質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)。

凱杰QIAGEN質(zhì)粒中提試劑盒、簡石去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒TD429、Biomiga質(zhì)粒提取試劑盒代理——天津益元利康生物科技有限公司，歡迎咨詢！！

一、輻射五大服務(wù)方向：

  1.國內(nèi)試劑耗材經(jīng)銷代理；

  2.國外試劑訂購（直訂，或境外代理）；

  3.基因組測序（二代，二代+三代）；

  4.基因分型（SNP檢測）：低/中/中 高通量項(xiàng)目；

  5.生物樣本運(yùn)輸（國內(nèi)、）；

二、多家代理品牌，涉及30多種較有名品牌，經(jīng)營代理500多個品牌：

Qiagen、Sigma、R&D、Epigentek、ThermoFisher、DNA Genotek、USA Scientific、Matreya、Sage Science、List Labs、Macrocyclics、Steraloids、NIBSC、mobio、immunodx、cellsystems、medicago、abcam、CST、Roche、Bethyl、sino Biological、clodrosome、adi BIO-WORLD、TOKU-E、HYPHEN BioMed、moltox、ZeptoMetrix、International Humic、biocytex、Toxin Technology  、Streck、Elastin、biomax、Orflo Technologies、Accegen、Advbiomart、genlantis、R&D、Cygnus Technologies LLC、Enzyme Research、Bio/Data Corporation、Greer Lab 、Solarbio、bangslabs、bioline、musechem、Novocastra stemrd、hyphen-biomed、polyplus、moltox 、exiqon、pentapharm、verichemlabs、GenStar、ALZET、lucernatechnologies 、meridian、origene、zimmerpeacocktech、horizondiscovery、Reagents、megazyme、elisasystems………

  所有生物試劑耗材都可以進(jìn)口，特別是冷門品牌，均能給客戶購買到。價格優(yōu)，貨期短，可加急，快10天到貨；保證服務(wù)質(zhì)量，所有產(chǎn)品均提供售后服務(wù)。大部分客戶我們提供貨到付款服務(wù)，

  公司自成立依靠過硬的服務(wù)和良好的信譽(yù)與各大企事業(yè)單位、科研單位建立長期合作。客戶包括北大，清華，地大，中科院各所，各大藥企等等。

  專業(yè)訂購國內(nèi)外試劑耗材，常備現(xiàn)貨，一手貨源，歡迎合作。