破解固定后染色難題的五大策略

一、抗原修復(fù)技術(shù)

原理：通過高溫（熱修復(fù)）或蛋白酶K處理，破壞交聯(lián)鍵，暴露被封閉的抗原表位。

方法：

熱修復(fù)：將切片浸入pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液，微波加熱至95℃維持15分鐘。

酶消化：使用0.05%-0.1%胰蛋白酶37℃處理10-30分鐘（適用于疏松組織）。

二、優(yōu)化固定條件

固定劑選擇：

固定時間控制：

小塊組織（<5mm3）固定不超過24小時，避免過度交聯(lián)。

三、穿透增強處理

去垢劑應(yīng)用：0.1%-0.3% Triton X-100處理10分鐘，增加細胞膜通透性。

凍融循環(huán)：將組織反復(fù)凍融（-80℃?室溫），破壞致密結(jié)構(gòu)（慎用于脆弱樣本）。

四、封閉內(nèi)源性干擾物

內(nèi)源性過氧化物酶：3% H?O?室溫處理10分鐘。

自發(fā)熒光：0.1% Sudan Black B乙醇溶液浸泡10分鐘（適用于醛基固定樣本）。

五、試劑與染色方案適配

抗體驗證：選擇經(jīng)固定組織驗證的一抗（查閱文獻或說明書標注“IHC/IF validated"）。

染料適配：

核酸染料：優(yōu)先選用抗固定型染料（如DAPI替代Hoechst）。

熒光標記：避免使用與自發(fā)熒光波長重疊的探針（如Cy5替代FITC）。

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