一個成功的IHC實驗，以下七個環節至關重要，如同一個精密的鏈條，缺一不可。

免疫組化（IHC）核心技術要點一：樣本制備 - 基石

組織固定：

要點： 及時、充分、適度。離體組織應盡快（通常30分鐘內）放入足量（10-20倍體積）的10%中性福爾馬林緩沖液中。

目的： 保存抗原性，防止降解和彌散。固定不足會導致抗原丟失；固定過度會遮蔽抗原表位，導致后續抗原修復困難。

石蠟包埋與切片：

要點： 組織脫水、透明、浸蠟過程要ce底但不過度。切片厚度通常為3-5μm，要求平整、無褶皺、無裂痕。

目的： 獲得高質量的組織切片，為后續染色提供基礎。

免疫組化（IHC）核心技術要點二：抗原修復 - 關鍵步驟

為什么需要： 福爾馬林固定會使蛋白質交聯，遮蔽抗原表位?？乖迯偷哪康氖谴蚱七@些交聯，使抗原重新暴露。

主要方法：

熱誘導表位修復（HIER）： zui常用。使用檸檬酸鹽（pH 6.0）或EDTA/EGTA（pH 8.0-9.0）緩沖液，在微波爐、高壓鍋或水浴鍋中加熱。pH值的選擇對某些抗體至關重要。

酶消化修復： 使用胰蛋白酶、胃蛋白酶等。適用于部分固定過度或特定抗原。

要點： 根據目標抗原和一抗說明書，優化修復方法和pH值。修復后需自然冷卻，避免驟冷。

免疫組化（IHC）核心技術要點三： 內源性過氧化物酶阻斷

要點： 在加入一抗前，用3% H?O?溶液處理切片，孵育10-15分鐘。

目的： 阻斷組織內源性的過氧化物酶（尤其在紅細胞、粒細胞中），防止在后續DAB顯色時產生非特異性背景著色。

免疫組化（IHC）核心技術要點四：封閉

要點： 使用與二抗來源同種的正常血清（如，二抗是山羊抗兔，則用正常山羊血清）或BSA（牛血清白蛋白），室溫封閉20-30分鐘。

目的： 封閉組織切片上非特異性的蛋白質結合位點，減少一抗、二抗的非特異性吸附，降低背景。

免疫組化（IHC）核心技術要點五：抗體孵育- 核心反應

一抗孵育：

要點： 抗體濃度、孵育時間和溫度是三大關鍵變量。必須參照說明書并進行預實驗優化。孵育通常在4°C過夜（特異性好）或室溫1-2小時（快速）。

目的： 特異性識別并結合目標抗原。

二抗孵育：

要點： 二抗需與一抗的種屬和亞型匹配。通常室溫孵育30-60分鐘。

目的： 攜帶標記物（如酶HRP或熒光基團）與一抗結合，起放大信號的作用。

免疫組化（IHC）核心技術要點六：顯色

要點： zui常用的是DAB（二氨基聯苯胺） 顯色。DAB在HRP催化下產生棕褐色不溶性沉淀。

關鍵： 鏡下控制顯色時間！ 通常在顯微鏡下觀察，待特異性信號清晰而背景未著色時立即終止反應（一般幾十秒到幾分鐘）。時間過短則信號弱，過長則背景深。

其他： AEC（紅色）等，但產物溶于有機溶劑，需水性封片劑封片。

免疫組化（IHC）核心技術要點七：復染、脫水、封片

復染： 常用蘇木精（Hematoxylin） 對細胞核進行藍色復染，提供組織形態學對照。

脫水透明： 經酒精梯度脫水，二甲苯透明，使組織透亮。

封片： 使用中性樹膠封片，長期保存。

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